Walory środowiska przyrodniczego Puszczy Niepołomickiej sprawiły, że jej tereny objęto ochroną prawną.

Od kilku lat cała Puszcza – wraz z lasami Grobla i Grobelczyk, a także łąkami w dolinie Drwinki między dwiema częściami Puszczy oraz pasem łąk między uroczyskiem Grobelczyk a lasem Grobla – należy do sieci obszarów Natura 2000. Wydzielono trzy takie obszary na terenie puszczy.

• Obszar Natura 2000 Koło Grobli PLH120008
  – powierzchnia: 599,63 ha,
  – głównym przedmiotem ochrony są: grąd środkowoeuropejski, lasy łęgowe i nadrzeczne zarośla wierzbowe oraz starorzecza i inne naturalne eutroficzne zbiorniki wodne.
• Obszar Natura 2000 Torfowisko Wielkie Błoto PLH120080
  – powierzchnia: 347,89 ha,
  – chronione są tu torfowiska niskie występujące na częściowo rolniczo użytkowanej polanie Wielkie błoto oraz zwarte populacje: modraszka teleiusa, modraszka nausithousa i czerwończyka nieparka.
• Obszar Natura 2000 Puszcza Niepołomicka PLB120002
  – powierzchnia: 11.762,3 ha,
  – przedmiotem ochrony są ptaki: puszczyk uralski, dzięcioł czarny, dzięcioł średni i muchołówka biało szyja.

Prócz obszarów Natura 2000 na terenie Puszczy Niepołomickiej istnieje kilka rezerwatów przyrody.

• Dębina
  – powierzchnia 12,66 ha;
  – ochrona ścisła, ochrona pozostałości fragmentów dawnej puszczy;
• Długosz Królewski
  – powierzchnia: 24,14 ha;
  – ochrona częściowa, ochrona naturalnych stanowisk występowania paproci Osmunda regalis, rzadkiej w świecie paproci długosz królewski;
• Gibiel
  – powierzchnia: 28,89 ha;
  – ochrona częściowa, zachowanie fragmentów dawnej puszczy;
• Koło 
  – powierzchnia: 3,49 ha;
  – ochrona częściowa, zachowanie fragmentów dawnej puszczy;
• Lipówka
  – powierzchnia: 25,73 ha;
  – ochrona ścisła, ochrona i zachowanie naturalnego starodrzewu o charakterze puszczańskim;
• Wiślisko Kobyle
  – powierzchnia: 6,70 ha;
  – ochrona częściowa, starorzecze Wisły stanowiące miejsce lęgowe dla wielu chronionych gatunków ptactwa z bogatymi zbiorowiskami roślinnymi.