Walory środowiska przyrodniczego Puszczy Niepołomickiej sprawiły, że jej tereny objęto ochroną prawną.
Od kilku lat cała Puszcza – wraz z lasami Grobla i Grobelczyk, a także łąkami w dolinie Drwinki między dwiema częściami Puszczy oraz pasem łąk między uroczyskiem Grobelczyk a lasem Grobla – należy do sieci obszarów Natura 2000. Wydzielono trzy takie obszary na terenie puszczy.
- Obszar Natura 2000 Koło Grobli PLH120008
– powierzchnia: 599,63 ha,
– głównym przedmiotem ochrony są: grąd środkowoeuropejski, lasy łęgowe i nadrzeczne zarośla wierzbowe oraz starorzecza i inne naturalne eutroficzne zbiorniki wodne. - Obszar Natura 2000 Torfowisko Wielkie Błoto PLH120080
– powierzchnia: 347,89 ha,
– chronione są tu torfowiska niskie występujące na częściowo rolniczo użytkowanej polanie Wielkie błoto oraz zwarte populacje: modraszka teleiusa, modraszka nausithousa i czerwończyka nieparka. - Obszar Natura 2000 Puszcza Niepołomicka PLB120002
– powierzchnia: 11.762,3 ha,
– przedmiotem ochrony są ptaki: puszczyk uralski, dzięcioł czarny, dzięcioł średni i muchołówka biało szyja.
Prócz obszarów Natura 2000 na terenie Puszczy Niepołomickiej istnieje kilka rezerwatów przyrody.
- Dębina
– powierzchnia 12,66 ha;
– ochrona ścisła, ochrona pozostałości fragmentów dawnej puszczy; - Długosz Królewski
– powierzchnia: 24,14 ha;
– ochrona częściowa, ochrona naturalnych stanowisk występowania paproci Osmunda regalis, rzadkiej w świecie paproci długosz królewski; - Gibiel
– powierzchnia: 28,89 ha;
– ochrona częściowa, zachowanie fragmentów dawnej puszczy; - Koło
– powierzchnia: 3,49 ha;
– ochrona częściowa, zachowanie fragmentów dawnej puszczy; - Lipówka
– powierzchnia: 25,73 ha;
– ochrona ścisła, ochrona i zachowanie naturalnego starodrzewu o charakterze puszczańskim; - Wiślisko Kobyle
– powierzchnia: 6,70 ha;
– ochrona częściowa, starorzecze Wisły stanowiące miejsce lęgowe dla wielu chronionych gatunków ptactwa z bogatymi zbiorowiskami roślinnymi.